KAJ JE SPUTUM?
Kužnina iz spodnjih dihal!
Pacient si s krtačko umije zobe, usta splakne s toplo vodo. Če ima protezo, naj jo odstrani.
Globoko se izkašlja v sterilno posodico. Najboljši je jutranji sputum.
KDAJ JEMLJEMO SLINO?
Slina je zaščitni izloček. Jemljemo jo, ko dokazujemo viruse (bakterije ne).
Urin = URINOKULTURA
Iztrebek = KOPROKULTURA
Možganska tekočina = pri meningitisih; s punkcijo v ledvenem delu
Kri – kadar je sum na vdor bakterij v kri = BAKTERIEMIJA – gre za začasen vdor bakterij, brez simptomov.
Odvzamemo kri za mikrobiološke preiskave – HEMOKULTURA.
BAKTERIEMIJA – prisotnost bakterij v krvi.
SEPSA – bakteriemija in znaki hude okužbe.
ODVZEM KRVI ZA HEMOKULTURO
Povzročitelje sepse ali bakteriemije dokažemo s postopkom, ki ga imenujemo hemokultura.
Hemokultura je postopek, pri katerem pacientovo kri zasejemo v tekoče gojišče za izolacijo bakterij in gliv, z namenom, da bi iz krvi izolirali povzročitelje bakteriemije ali sepse.
Najpogostejše po Gramu pozitivne bakterije, ki povzročajo bakteriemijo so: stafilokoki, enterokoki in pnevmokoki.
Med po Gramu negativnimi bakterijami pa so najpogostejše: Eschericha coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa.
Med glivami pa je najpogosteje Candida albicans.
Kri za hemokulturo jemljemo praviloma takrat, ko pacientu temperatura narašča. Za ugotovitev povzročitelja septičnega stanja je dovolj odvzeti 3 hemokulture v 24 urah.
Kri jemljemo iz vene strogo aseptično. Odvzemno mesto najprej umijemo s toplo vodo in milom, nato ga dezinficiramo s 70 % alkoholom oz. ustreznim razkužilom katerega uporablja ustanova.
Kri odvzamemo s sterilno iglo in brizgalko, še bolje je, da uporabimo sterilni sistem, ki je del hemokulturnega kompleta. Gojišče za hemokulturo moramo pred odvzemom segreti na sobno temperaturo. Enako kot smo razkužili vbodno mesto pri pacientu, razkužimo tudi gumijasti zamašek na steklenici z gojiščem. Ko smo pacientu odvzeli 10 ml krvi, iglo na brizgalki zamenjamo, prebodemo z njo zamašek na hemokulturni steklenici in izbrizgamo kri med rahlim tresenjem steklenice. Na ta način se pacientova kri dobro vmeša v gojišče. Steklenico natančno označimo in postavimo v termostat do prenosa v bakteriološki laboratorij.
Hemokulture naj spremlja napotnica za mikrobiološko preiskavo s potrebnimi podatki. Zlasti je pomembno, da je na spremnem listu pacientova diagnoza oz. zdravnikov sum, da ima pacient npr. endokarditis.
PRAVO KUŽNINO OB PRAVEM ČASU – KAJ TO POMENI?
Takrat, ko navzočnost bakterij pričakujemo na tistem mestu!
OPTIMALEN ČAS ODVZEMA naj bo določen glede na največjo verjetnost uspešne izolacije oz. drugih dokazov povzročitelja.
Kužnino za mikrobiološko preiskavo moramo odvzeti pred pričetkom antibiotičnega ali drugega protimikrobnega zdravljenja.
IZBOR PRAVE KUŽNINE – prava kužnina je tista, v kateri se pri določeni bolezni v določeni stopnji nahajajo mikroorganizmi.
SPREMNI LIST!
Dokument, ki spremlja vsako kužnino. Na njem so zapisani osnovni podatki o pacientu, klinična slika pacienta, vrsta kužnine, katero preiskavo želimo….
Podatki o pacientu: ime, priimek, datum rojstva, naslov, klinični znaki in diagnoza, nosečnost, rezultati prejšnje preiskave, antibiotična terapija, začetek obolenja.
Žig in podpis zdravnika.
Datum odvzema kužnine.
Mesto odvzema kužnine – opis kužnine, anatomsko mesto odvzema kužnine (npr. bris žrela, bris nosu, bris rane….).
Seznam preiskav – označimo želeno preiskavo (npr. MRSA, beta hemolitični streptokok, salmonele in šigele…).
KAJ JE V NAŠEM TELESU STERILNO?
Kri, sečni mehur – urin v sečnem mehurju je sterilen, ko priteče ven pa ni več, likvor, notranji organi (črevo ni sterilno – tam je ogromno bakterij, zato tudi smrdi blato).
V telesu so različna mesta, kjer v normalnih okoliščinah ni mikroorganizmov (vsa mezodermalna tkiva zdravih ljudi so sterilna). Pri zdravem človeku je sterilen likvor, kostni mozeg, kri, mišice, parenhimski organi in telesne votline: plevralna, perikardialna in peritonealna.
Pri infekcijah lahko najdemo mikroorganizme v vseh navedenih tkivih in vsak mikroorganizem, ki ga izoliramo, je lahko povzročitelj bolezni. Zato so potrebni pri odvzemu strogo aseptični pogoji, da ne proglasimo kontaminantov pri odvzemu materiala za povzročitelje okužbe.
PRIONI!
Prioni so patološke beljakovine (prion je beljakovinski kužni delec brez nukleinske kisline). Povzročajo Creutzfeld-Jakobovo bolezen, pri živalih pa nore krave.
Niso mikroorganizmi. Uničimo jih z enournim avtoklaviranjem pri 132 – 142°C ali pa enourno namakanje v eno normalnem natrijevem lugu (1 N NaOH) ali pa dve urno namakanje v natrijevem hipokloridu.
KAJ JE CFU?
CFU (colony forming units) = število bakterij, ki so na gojišču še sposobne narediti kolonijo!!!
1 bakterijska kolonija = rast ene same bakterijske celice
AGAR = gojišče, na katerem zrastejo bakterije!
KAKO NAREDIMO KRVNI AGAR?
Veterinar odvzame kri govedi, jo skuha, doda agar, posamezne aminokisline, beljakovine in soli. To je tekoče in se naliva v petrijevke – pusti se odprto, da se strdi, nato pa se da v hladilnih za 14 dni.
MEŠANA KULTURA, ČISTA KULTURA
Patogeni mikroorganizmi živijo pretežno v družbi drugih mikroorganizmov, patogenih ali saprofitnih, zato v kužnini, ki je vzeta s predelov, kjer je prisotna normalna flora, najdemo množico različnih mikrobov, ki spremljajo povzročitelja bolezni. Ko gojišča zasejemo, zrastejo zato po inkubaciji različne bakterijske vrste, ki so bile v kužnini. Na gojišču dobimo različne kolonije, kar imenujemo MEŠANA KULTURA.
Če je v materialu samo ena bakterijska vrsta (npr. če je kužnina iz normalno sterilnega področja), bodo zrasle na gojišču enake kolonije, dobili smo ČISTO KULTURO.
KAKO DOBIMO ČISTO KULTURO?
Za identifikacijo bakterij je neizogibno imeti čisto kulturo. Iz mešane kulture, ki smo jo dobili po primarnem zasajanju kužnine, moramo precepiti vsako sumljivo kolonijo na novo gojišče, kar napravimo tako, da prenesemo (pikiramo) izbrano kolonijo bakterij na novo gojišče. Ko imamo čisto kulturo, napravimo mikroskopski preparat, ga posušimo na zraku, fiksiramo v metanolu ali nad plamenom plinskega gorilnika in ga pobarvamo po Gramu.
KAKO SE VZAME BRIS ŽRELA?
S sterilnim brisom obrišemo levo in desno tonzilo ter žrelni lok, nato pa kužnino na brisu zasejemo z brisom neposredno na gojišče krvnega agarja.
Zasejemo tako: kužnino najprej odložimo na rob gojišča, nato pa s sterilno cepilno zanko napravimo najprej izolacijsko črto in nato kužnino »redčimo« (razmažemo) s cepilno zanko čez vso ploščo. Krvni agar označimo z imenom in datumom. Inkubiramo pri 37°C 24 ur.
– Pred odvzemom vzorca morajo biti tonzile in žrelo dobro vidni in dobro osvetljeni.
– Ko pritisnemo jezik navzdol, odvzamemo bris s tonzil in žrela ter pazimo, da se ne dotaknemo sluznice lic ali jezika.
– Želeno mesto močno pobrišemo (bele pike, vneto mesto, sluznico pod membranami), bris med rotiranjem rahlo pritisnemo.
– Bris pošljemo v laboratorij takoj. Če bo trajal transport (čas od odvzema vzorca do sprejema v mikrobiološki laboratorij) dlje od dveh ur, vložimo bris v ustrezno transportno gojišče, hranimo pri sobni temperaturi. V laboratorij pošljemo najkasneje v 24 urah po odvzemu v prenosni torbi pri 20-25°C.
BARVANJE PO GRAMU! OPIŠI PRINCIP BARVANJA PO GRAMU!
Barvanje po Gramu nas usmeri, kaj bomo delali najprej.
Po Gramu negativne bakterije se obarvajo rdeče, po Gramu pozitivne bakterije pa vijolično (imajo veliko peptidoglikana).
Princip je razlika v celični steni!
S cepilno zanko posnamemo nekaj kolonij in napravimo razmaz za barvanje po Gramu. Na predmetno stekelce kanemo kapljico destilirane vode in vanjo vmešamo posnete bakterijske kolonije. Z bakteriološko zanko napravimo razmaz in ga posušimo na zraku. Preparat fiksiramo v plamenu tako, da stekelce nekajkrat potegnemo skozi vrhnji del plamena gorilnika s hitrostjo kot bi rezali kruh.
Barvamo po naslednji shemi:
– preparat prelijemo za 1 do 2 minuti z raztopino barvila metilvijolično
– odlijemo barvilo in speremo z vodo
– prelijemo za 1 minuto z lugolovo raztopino
– odlijemo lugol in počasi razbarvamo s 3 % mešanico aceton – alkohola, ki naj deluje 30 sekund
– speremo z vodo
– barvamo s fuksinom 30 sekund
– speremo z vodo in posušimo na zraku
Posušen preparat mikroskopiramo, najprej z majhno, nato z večjo povečavo, končno pa z imerzijskim objektivom.
SESTAVA MIKROSKOPA!
Pri vsakodnevni bakteriološki diagnostiki je mikroskopiranje ključni postopek pred nadaljnjo identifikacijo bakterij. Uporabljamo svetlobni mikroskop. Bakterije v obarvanih preparatih opazujemo pod 1000-kratno povečavo.
Ostro sliko si zagotovimo z dodatkom kaplje imerzijskega olja na mesto na objektnem stekelcu, kjer pričakujemo optimalno količino bakterij, ki jih želimo videti. Imerzijsko olje zmanjša odbojni kot svetlobe na poti med objektom in objektivom, ker ima enak lomni količnik kot steklo. Tako pride v leče mikroskopa več svetlobe in vidimo jasnejšo sliko.
Ob pregledu preparata pod mikroskopom dobimo informacijo o tem, ali je bakterija po Gramu pozitivna, ugotovimo obliko in razporeditev bakterijskih celic.
KDAJ OVLAŽIMO BRISE?
Brise ovlažimo takrat, ko posegamo na suho področje (npr. bris nosu – navlažimo s fiziološko raztopino). Bris žrela pa ni treba navlažiti.
KAKO VZAMEMO BRIS IZ GRDEGA DEKUBITUSA?
Najprej očistimo rano. Posegati moramo čim globlje (pri globoki rani).
KAKO OZNAČIMO KUŽNINO?
Ime, priimek, letnica rojstva.
HEMOKULTURO IN LIKVOR ne smemo shraniti v hladilnik!!!!
SANFORD – metoda srednjega curka.
Urin je zelo dobro gojišče za bakterije, čeprav je pri zdravem človeku sterilen, dokler je v sečnem mehurju. Pri naravnem uriniranju izplakne urinski curek bakterije, ki so normalno navzoče v zunanji tretjini uretre, zato vsebuje urin vedno nekaj bakterij.
Najpogosteje jemljemo urin po metodi »čistega mokrenja«.
Po temeljitem umivanju anogenitalnega predela s toplo vodo in milom, spusti pacient prvi curek urina v školjko, drugi curek urina prestreže v sterilno posodo, zadnjega pa spet spusti v školjko. V stekleno posodo s širokim vratom prestreženi srednji curek urina prenesemo v sterilno steklenico (sanfordka), le-to tesno zapremo in do prenosa v laboratorij shranimo v hladilniku, da se bakterije ne bi razmnoževale. Od odvzema vzorca do prenosa v laboratorij ne sme preteči več kot 2 uri. Prenesemo ga v hladilni torbi. Za preiskavo potrebujemo navadno 3 – 5 ml urina.
Z metodo čistega mokrenja odvzeti urin preiskujemo v laboratoriju kvantitativno po Sanfordu. S tem postopkom določimo število bakterij v 1 ml urina. Kot patološki vzorec ocenimo tisti urin, v katerem smo ugotovili več kot 100.000 bakterij v 1 ml urina. V takem primeru govorimo o značilni bakteriuriji.
URIKULT
Urinokultura – je metoda, kjer kanemo 1 kapljo (0,1 ml) nerazredčenega urina na gojišče. Po inkubaciji identificiramo porasle CFU in testiramo občutljivost na antibiotike. Ne podajamo števila.
NAVEDI ČASOVNO ZAPOREDJE PRI IDENTIFIKACIJI BAKTERIJE!
Odvzem kužnine.
Zasejanje na gojišče.
Mešana kultura.
Čista kultura.
Barvanje po Gramu.
Specifična identifikacija – biokemijska identifikacija.
Serotipizacija.
Antibiogram.
HEMOLIZA – raztopljen agar na krvni plošči.
Bakterije rabijo od 18 do 24 ur, da prikažejo rast na gojišču.
OPAZOVANJE KOLONIJ!
Gledamo:
ali so kolonije bele ali pigmentirane (imajo pigment – npr. z rumenim pigmentom)
ali so suhe ali sluzaste
ali imajo gladek ali nazobčen rob
pomembna lastnost je hemoliza
Za identifikacijo je pomemben izgled bakterijskih kolonij. Te značilnosti opazujemo potem, ko smo izolirane bakterijske seve zasejali na različna gojišča.
Na ta način ugotavljamo:
rast v bujonu (na dnu, površini, ob steni epruvete…)
rast v globokem agarju (na površini, pod površino, le v globini, v vseh plasteh)
kolonije na površini agarja, lastnosti kolonij (oblika, velikost, barva kolonij in okolice, površina, profil, rob, prosojnost, konsistenca)
BIOKEMIJSKA IDENTIFIKACIJA!
Ugotavljamo biokemijsko aktivnost bakterij. Gledamo prisotnost določenih encimov.
Biokemijsko identifikacijo delamo na objektnih stekelcih ali na gojiščih.
V epruveti pripravljeno suspenzijsko kulturo biokemično identificiramo s testi:
fermentacija laktoze / glukoze
hidroliza uree, dokaz encima ureaze
razgradnja triptofana do indola, dokazujemo prisotnost indola
reakcija – metilensko rdeče (MR)
reakcija po Voges – Proskauerju (VP)
citrat, dokaz ali bakterija raste, če ima na voljo le citrat kot edini vir ogljika
H2S reakcija, razgradnja beljakovin s sproščanjem žveplovodika
Dokaz gibljivosti bakterije
KAJ NAM ŠE POMAGA PRI UGOTAVLJANJU BAKTERIJ?
Ali bakterija nujno rabi kisik ali je anaerobna.
Npr. bacil tetanusa je anaerob. Pa vranični prisad tudi.
Potrebe po kisiku ugotavljamo z zasejavanjem izolirane bakterije v »globoki« agar. Nekatere bolje uspevajo ob dodatnih količinah CO2.
KAKO ZAGOTOVIMO ANAEROBNO ATMOSFERO?
Plošče damo v lonec, v lonec damo petrijevke, kjer imamo zasejane bakterije, na vrh damo gorečo svečo in zapremo. Sveča neha goreti, ko ni več kisika. Namesto sveče se danes uporabljajo kemijske snovi.
Lonec za anaerobno kultiviranje – kadar želimo identificirati patogeno anaerobno bakterijo.
SEROTIPIZACIJA!
Je ugotavljanje antigenske zgradbe bakterije.
ANTIGEN – je vsaka tuja snov, ki v organizmu izzove nastanek specifičnih protiteles.
ANTISERUM – serum, ki ima protitelesa proti določeni bakteriji. Dobijo ga z imunizacijo živali (žival mora biti zdrava). V kunca ali kozo inokulirajo (vcepijo) določeno salmonelo in ta žival bo tvorila protitelesa proti tej salmoneli. Antiserum vsebuje protitelesa proti točno določeni salmoneli.
ANTIBIOGRAM – ugotavljamo na katere antibiotike je naša bakterija odporna.
DIFUZIJSKI ANTIBIOGRAM
Je preprost in hiter test. Primerno gosto suspenzijo bakterijske kulture zasejemo na površino trdnega gojišča v petrijevki. Na zasejano kulturo nato polagamo antibiotične diske ali tablete (antibiotiki so naneseni na standardizirane papirnate diske, ali so stisnjeni v tabletke). Antibiotik difundira z diska v gojišče in zavre rast bakterij okoli diska (tabletke).
V primeru, da je mikrob občutljiv za antibiotik, nastane okoli diska pas zaviralne rasti (zaviralni pas ali cona inhibicije) – to je področje, kjer ni vidne rasti bakterij. Antibiogram ovrednotimo navadno po 24 urni inkubaciji.
KAKO VREDNOTIMO REZULTAT DIFUZIJSKEGA ANTIBIOGRAMA?
Pri vrednotenju inhibicijskih con upoštevamo navodila proizvajalca, ki so priložena antibiotikom. Za vsak antibiotik izmerimo premer inhibicijske cone (v mm) in v tabeli odčitamo občutljivost testiranega bakterijskega seva.
Občutljivost izoliranega seva označimo:
rezistenten (0)
slabo občutljiv (+)
srednje občutljiv (++)
zelo občutljiv (+++)
SUSPENZIJA – bakterije v tekočini
DILUCIJSKI ANTIBIOGRAM – delamo ga, ko hočemo določiti MIC in MBC – ko imamo kakšen kompliciran primer; ko je pacient že imel več antibiotikov – ko moramo ciljano dajati antibiotike.
Dilucijska metoda je primerna za testiranje mikrobov, ki se razmnožujejo samo v tekočih gojiščih, ali kadar preskušamo antibiotike, ki v agar slabo difundirajo.
V posebnih okoliščinah, npr. pri sepsah, ko osamimo povzročitelja iz pacientove krvi ali tedaj, kadar zdravljenje z antibiotiki ni uspešno, kljub znani občutljivosti bakterije za antibiotik, delamo kvantitativen antibiogram.
Izolirani mikroorganizem zasejemo v vrsto epruvet z gojiščem z znanimi, padajočimi koncentracijami antibiotika. Inkubiramo 18 – 24 ur pri 37°C in opazujemo, katera najmanjša koncentracija antibiotika še zavre rast. Preskus nam pove minimalno inhibitorno koncentracijo – MIC in tudi največjo tolerantno koncentracijo antibiotika, pri kateri se mikrob še razmnožuje. Zdravljenje je navadno uspešno, če dobi pacient dvakratno MIC antibiotika.
Baktericidno delovanje antibiotika pa dokažemo tako, da precepimo bakterije iz vseh epruvet brez vidne motnosti na sveža trda gojišča in ugotovimo, pri kateri razredčini antibiotika bakterije ne porastejo več. Ta razredčina je baktericidna – minimalna baktericidna koncentracija – MBC.
MOLEKULARNO BIOLOŠKE METODE – neposredni dokazi bakterijskih povzročiteljev – vendar ne dokazujejo celega povzročitelja, ampak samo del.
PCR – verižna reakcija s polimerazo. Je metoda pomnoževanja delcev nukleinskih kislin.
Pri tej metodi uporabljamo en sam encim, temperaturno obstojno polimerazo DNK.
V seroloških reakcijah gre za reakcijo antigen – protitelo.