Mikrobiologija teorija in praksa

Navodila za delo v mikrobiološkem laboratoriju

• Delo z živimi (patogenimi) mikroorganizmi
• Aseptična tehnika (okužba vzorca, okužba laboranta)
• Aseptični pogoji (gorilnik, komora)
• Zaščitna obleka
• Umivanje in razkuževanje rok
• Razkuževanje delovnih površin
• Posode za odlaganje kužnega materiala
• Uporaba sterilnega materiala (sterilizacija, ožiganje ob ognju)
• Pipetiranje (avtomatske pipete-ne z usti)
• Ne jemo in ne pijemo

 

Nesreče

• Gorilnik (opekline)
• Politje kužnine po delovnem pultu
• Vreznine

Po končanem delu:

• Pospravimo delavno površino
• Ugasnemo gorilnik
• Pospravimo material
• Mikroskop (očistimo, pospravimo)
• Razkužimo pult
• Umijemo, razkužimo roke
• Slečemo haljo

 

Mikroorganizmi:

• Mikroorganizem je organizem, ki je tako droben, da ni viden s prostim očesom in ga lahko opazujemo le z mikroskopom.
• Mikroorganizmi:
• bakterije
• virusi
• enocelične rastline
• enocelične glive
• enocelične živali

 

Glede na delovanje jih, razdelimo na:

• Tehnološko koristne (v proizvodnji hrane in učinkovin)
• Tehnološko škodljive (kvarjenje)
• Patogene (ogrožajo zdravje)
• Normalna mikroflora

 

Mikroflora pri človeku

• Na sluznici in koži človeka
• Stalna in prehodna mikroflora
• Normalna mikroflora (koristna)
• Patogeni lahko porušijo mikrofloro
• Mikroorganizmi v organih, krvi ali limfnem sistemu – obolelost

 

Preprečevanje razmnoževanja mikroorganizmov

• Zračenje
• Čiščenje
• Razkuževanje
• Sterilizacija

 

Čiščenje

• Čiščenje, umivanje, pranje:
• detergenti
• vroča voda (65-95°C)
• segrevanje v vodni pari pri znižanem tlaku, itd.
• Ob pravilnem čiščenju uničimo 80-90% navzočih mikroorganizmov. Spor ne uniči

 

Razkuževanje in razkužila

• Uniči vegetativne oblike mikroorganizmov
• Večina razkužil ne deluje na bakterijske spore.
• Število mikroorganizmov se zmanjša za 99%.
• Razkuževanje v zdravstvenih ustanovah, farmaciji, živilska industrija, otroški vrtci
• Postopki razkuževanja:
• fizikalni postopki (s toploto)
• kemijski postopki

 

Razkuževanje s toploto

• Pasterilizacija
• Segrevanje v vreli vodi
• Tindalizacija
• Živilska industrija:
• Pasterizacija (le uničenje vegetativnih oblik mikroorganizmov), za zagotavljanje daljše obstojnosti mleka, vina, piva, sadnih sokov, zelenjave, utd.
• Trije postopki:
• 63°C – 30 minut
• 72°C – 15 minut
• 85°C – 10-15 sekund
• Segrevanje v vreli vodi ali vodni pari:
• 100°C – 5 – 10 minut (uniči nekatere viruse)
• 100°C – 30 minut (uniči tudi nekatere spore)
• 80°C – 5 – 10 minut za toplotno občutljive predmete
• Tindalizacija:
• 105°C – 20 minut pri nadtlaku 0,3-0,5 bara
• Ponovimo 3x v presledku 24 ur
• Spore med ponovitvami germinirajo (preidejo v vegetativno obliko)

 

Kemijska zgradba razkužil:

• Kvarterne amonijeve spojine
• Amfoliti
• Fenol in derivati
• Alkoholi
• Aldehidi
• Halogeni
• Perkisline

Po razkuževanju lahko na površini ostanejo strupeni ostanki, zato je potrebno površino sprati z mikrobiološko neoporečno ali sterilno vodo

 

Na učinkovitost razkuževanja vplivajo:

1. 1. Čistost površin
2.       mehanično čiščenje, detergenti, spiranje z vodo, razkuževanje
3. Izjema: zelo kužen material najprej v razkužilo, pranje, sterilizacija ali razkuževanje
4. 2. Koncentracija razkužila (priporočilo proizvajalcev)
5.  – Dnevna priprava delovne raztopine razkužila (ostanek zavržemo) – uporabna 8 ur
6. 3. Čas delovanja:

    Odvisen od vrste mikroorganizmov, od materiala, itd.

         Delovanje od 0,5 ure do 2 ur (ne več kot 24 ur)

1. 4. Temperatura:
2. – boljši učinek (vroča voda uničujoča za celico)
3.  Vrsta mikroorganizmov:

– G+, G-, virusi, bakterijske in glivne spore

        Prilagoditev mikroorganizmov na razkužila

        Uporaba več razkužil hkrati

 

Antiseptiki

• So razkužila, ki jih uporabljamo na živih tkivih (razkužila za roke, kožo, sluznice)
• Učinkujejo po nekaj sekundah do 30 minutah
• Roke umijemo in posušimo, nato razkužimo

 

Spore bakterij

• Razkuževanje jih ne uniči
• Pomembni sporotvorni mikroorganizmi:
• Bacillus sp.: Bacillus aureus, Bacillus antracis itn.
• Clostridium: Clostridium botulinum, Clostridium tetani itn.
• Spore lahko uničimo s sterilizacijo

 

 

Sterilizacija

 Uničimo vse žive mikroorganizme, vključno s sporami gliv in bakterij ( št. se mora znižati za 10 ⁶)

• Uspešnost sterilizacije odvisna:

1. začetnega št. mikroorganizmov
2. čistosti materiala
3. embalaže, v kateri se sterilizira material

 č. od tipa sterilizacije

1. načina in časa hranjenja sterilizacije

 

Vrste sterilizacije

1. Fizikalne
2. Fizikalno-kemijske

 

Fizikalni postopki:

1. Avtoklaviranje (para, visoki tlak)
2. Suha sterilizacija
3. Ionizirajoči žarki (UV, žarki gama, žarki X)
4. Filtriranje
5. Žarenje (ob gorilniku- cepilne zanke)

 

Fizikalno-kemijski postopki:

1. a. Sterilizacija z etilen oksidom  ali propilen oksidom
2. b. Sterilizacija s plazmo
3. c. Sterilizacija z ozonom

 

Avtoklaviranje

• Vodna para pod pritiskom
• 121°C/15 minut-gojišča, 20-30 minut-dekontaminacija, 134 °C/4 minute
• Kovine, posebna plastika, gojišča, steklo, tkanina

 

Suha sterilizacija

• Temperatura do 200 °C (170-180/1-2 uri)
• Kovinski pribor, steklovina, praški, mazila, olja

 

Kontrola uspešnosti sterilizacije

• fizikalna (preverjanje temperature)
• kemijska (indikatorski trakovi, Brownove kapsule)
• Biološka npr.:
• spore stearothermophilus – za avtoklavirane
• spore subtilis var. niger – za suho sterilizacijo

 

Sevanje

• Žarki UV (240 – 280 nm)
• Uniči m.o. na površinah, tekočinah, zraku
• Nevarni za človeka (v praznih prostorih)
• Žarki Gama (radioaktivni Co⁶⁰)
• V farmaciji, izdelavi medic. izdelkov, živilstvu
• Žarki X
• Ni radioaktivnosti
• V živilstvu in medicini

 

Filtriranje

• Filtri s porami 0,45 μm ne prepuščajo bakterij
• Filtri s porami 0,20 μm ne prepuščajo bakterij in virusov

 

Ožiganje

• delo ob gorilniku

 

Kemijska sterilizacija

1. 1. etilen (propilen) oksid-plin
2.   – za termolabilne materiale
3.   – Izpostavljeni etilen oksidu pri T 45-65 °C
4.    – je citoplazemski strup, denaturacija beljakovin, inaktivacija DNK in RNK
5.   – deluje na bakterije, viruse, spore
6.    – strupen za človeka
7.    – prezračevanje  materiala po sterilizaciji (7-14 dni ostane plin na materialu)

2. Sterilizacija s plazmo

1. V manjših komorah
2.  v pari vodikovega peroksida pod  vplivom el. toka (konsistenca plazme)
3. Škodljivih ostankov ni
4. Termolabilen material, občutljiv na vlago
5. Kamere, endoskopi, optika, el. Naprave

3. Sterilizacija z ozonom O3

1. Za prostore
2. Zelo hitro razpade, zato pri kratkotrajni izpostavitvi nizkim koncentracijam ni toksičen za ljudi

 

Kužnina

• Vzorec, pri katerem pri določeni bolezni in v določeni stopnji ugotavljamo navzočnost mikroorganizmov, ki so možni povzročitelji obolenj
• Telesne tekočine, brisi, izločki, izpirki, delci tkiva in ostružki, bioptični material, konice katetrov itn.

 

 

 

 

ODVZEM IN PRENOS KUŽNIN ZA MIKROBIOLOŠKE PREISKAVE

• Splošna pravila:
• Varnost jemalca, bolnika, okolja
• Ohranitev identitete vzorca (označba + spremni list)
• Odvzem aseptičen
• Dovolj kužnine za preiskavo
• Redni kontakti z laboratorijem
• Primerno ravnanje z odvzetim kliničnim vzorcem (največ 2 uri do laboratorija – izjemoma dlje na 4°C)
• Splošna pravila:
• Varnost jemalca, bolnika, okolja
• Ohranitev identitete vzorca (označba + spremni list)
• Odvzem aseptičen
• Dovolj kužnine za preiskavo
• Redni kontakti z laboratorijem
• Primerno ravnanje z odvzetim kliničnim vzorcem (največ 2 uri do laboratorija – izjemoma dlje na 4°C)

 

 

Preiskava

1. Osnovna mikroskopija – screening test
2. Bakteriološko gojišče – priprava mešane kulture (virusi ne zrastejo)
3. Priprava čiste kulture
4. Diferencialna mikroskopija (ločevanje)
5. Identifikacija
6. Antibiogram ali antimikogram

 

Bakteriološka gojišča

• Gojišče je medij, v katerem m.o. rastejo in se razmnožujejo.
• Sestavine:
• Destilirana voda
• Mesni ekstrakt
• Kvasni ekstrakt
• Peptoni in triptoni
• Anorganske soli (NaCl, fosfati)
• Agar agar (ester galaktina in H₂SO₄), želira pri 40°C
• Ogljikovi hidrati (mono-, di-, tri-, polisaharidi),
• Vitamini, aminolisline, minerali, itd.

 

 

Vrste gojišč

• OSNOVNA (tekoča, trdna) (pept. voda, hranljivi agar, itd.)
• OBOGATENA (osnovnim dodamo npr beljakovine-kri, serum, mleko, jajca, itd.)
• BOGATITVENA pospešujejo razmnoževanje specifičnih bakterij
• DIFERENCIALNA na njih se morfološko ločijo različne skupine m.o.
• SELEKTIVNA zavirajo razmnoževanje drugih bakterij, pospešujejo rast želenih bakterij
• BIOKEMIČNA z dodanimi substrati (sladkorji, alkoholi, AK) za ugotavljanje biokemijske (metabolne) aktivnosti posameznih m.o., oz. njihovih encimov, omogočajo identifikacijo

 

Okoliščine, v katerih se gojijo mikroorganizmi v laboratoriju

• Gojišča
• pH
• Kisik (aerobi, mikroaerofilni, anaerobni)
• T (psihrofili: 10-15 °C, psihrotrofi: 20-30 °C, mezofili: 30-37 °C, termotrofi: 42-46 °C, termofili: 50-80 °C opt. T)

 

Gojenje anaerobnih bakterij

• Biološki način (Serratia marcescens na eno polovico gojišča, porabi kisik)
• Kemijske metode (v gojišču snovi, ki vežejo kisik: tioglikolat, cistein, vitamin C, itd.)
• Fizikalne metode (parafin, anaerobni lonci)

 

Kolonija

• Kolonija je skupek bakterijskih ali glivnih celic, ki so nastale z delitvijo ene materinske celice in so genetsko enake.

 

Kolonije

• Kolonije med seboj ločimo:
• Velikost
• Obliki (okrogla, točkasta, nitasta, nepravilna…)
• Barva (prozorne, sivo-bele, oranžne…)
• Površini (gladka, hrapava, svetleča, nagubana…)
• Profilu ali vzdignjenosti (ploska, dvignjena, vdrta…)
• Robu (raven, valovit, resast, nazobčen…)
• Strukturi ali ustroju (krhka, trda, mazava…)
• Prosojnosti (prosojna, motna…)
• Vonju (vonj po gnilem, po sadju, po akaciji…)
• Vpliv na gojišče (sprememba barve gojišča, precipitacijska cona, prozorna cona…)

 

 

 

Hemoliza

• Hemoliza– razgradnja hema eritrocitov v krvnem agarju (encim hemolizin)
• α-hemoliza: delna, zelenkasta cona okrog kolonij
• β-hemoliza: popolna, prozorna cona okrog kolonij
• γ-hemoliza: ni hemolize, ni vidne cone okrog kolonij

 

 

Mikroskopiranje

• Inštrument za gledanje in proučevanje predmetov, ki jih sicer s prostim očesom ne vidimo – manjši od 0,1 mm
• svetlobni mikroskopi, elektronski mikroskopi in konični čitalni mikroskop (SPM)
• Povečava: okular X objektiv
• Povečava: 40 x, 100 x, 400 x, 1000 x (imerzija)

 

Preparati

• Živi ali nativni preparati
• pokrita kaplica
• viseča kapljica
• Fiksirani preparati na stekelce

– barvanje

 

Barvanje

• Enostavno barvanje – poveča kontrast – lahko uporabimo več barvil
• Diferencialno barvanje – ločimo celice med seboj

 

Diferencialno barvanje

• Z barvanjem ocenjujemo:
• Obliko, velikost celic, razporeditev
• Prisotnost bičkov,
• Celične vključke
• Prisotnost spor
• Barvanje po Gramu

 

 

Barvanje po Gramu

• Po Gramu pozitivne bakterije
• Po Gramu negativne bakterije
• Razlika v strukturi celične stene
• Celična stena iz peptidoglikana
• Po Gramu negativne bakterije

– tanek sloj peptidoglikana (5 – 20 %)

– zunanja membrana

• Po Gramu pozitivne bakterije

– debel sloj peptidoglikana (90 %)

– zunanje membrane ni

 

Postopek barvanja po Gramu

1. Kristal vijolično: 1 – 2 min
2. Spiranje z vodo
3. Lugol: 1 – 2 min
4. Raztopina etanola in acetona (1:1): 20 s
5. Spiranje z vodo
6. Safranin: 1 min
7. Spiranje z vodo in sušenje

 

Glive

• Kraljestvo glive (fungi)
• Podobne živalim – po prehranjevanju – hrana je organska snov
• Podobne rastlinam – po morfoloških lastnostih

 

• Kvasovke (enocelične)
• Plesni (večcelične)
• Glive ločujemo po obliki micelija, načinu razmnoževanja, obliki spor in obliki sporangijev

 

Kvasovke

• MIkroskopske
• Kroglaste oblike – nepravilnih oblik
• Večje od bakterij (4 do 16 μm)
• Nespolno razmnoževanje (brstenje)-nastanek novih celic blastospor.

 

Plesni

• Večcelični organizmi
• Sestavljene iz hif, ki tvorijo micelij (nitaste oblike):

– bazalni micelij – v podlagi – hrana, pritrditev

– zračni micelij – na površini – za razmnoževanje

• Na zračnem miceliju nastane konidiofor na katerem nastanejo spore konidiji
• Spore gliv namenjene razmnoževanju

 

Dimorfne glive

• Lahko so v nitasti (plesni) ali kroglasti (kvasovke) obliki
• V naravi kot saprofiti v nitasti obliki
• Ob spremenjenih pogojih se spremenijo v kroglasto obliko in postanejo paraziti
• Pri tem spremenijo obliko, prehranjevanje in temperaturo rasti

 

Razmnoževanje gliv:

• Spolno
• Nespolno (spore na miceliju):
• Menjava spolne in nespolne generacije

 

Spolno razmnoževanje

• gametangiji – v njih nastajajo gamete (spolne celice)
• Askospore, bazidiospore in zigospore
• Dve haploidni (n) spolni spori dveh stelk se združita in nastane diploidni spojek (2n)
• V diploidnem spojku poteče mejoza – nastajo haploidne spore, ki v ugodnih razmerah kalijo

 

Nespolno razmnoževanje

• Konidiji – nespolne spore:
• Blastospore
• Sporangiospore
• Artrospore (oidiji)
• Klamidospore
• Odporne proti neugodnim življenskim razmeram
• Se lahko razširjajo po zraku

 

Glive – koristne in škodljive

• Koristne:
• v živilski industriji (alkoholno vretje, proizvodnja kruha, plesnivi siri…)
• v naravi (kroženje snovi, mikoriza)
• v biotehnologiji (proizvodnja sekundarnih metabolitov, encimov…)
• Škodljive:
• v kmetijstvu in živilstvu (kvarjenje pridelka in izdelkov)
• v zdravstvu (obolenja ljudi in živali)

 

Medicinsko pomembne glive

• Veda: mikologija, bolezni: mikoze, ugotavljanje občutljivosti gliv za antimikotike je antimikogram
• Bolezni:
• Alergije
• Dermatomikoze
• Toksikoze (tvorijo toksine)
• Sistemske mikoze

 

Alergije

• Vdihovanje spor in delov gliv
• Penicillium sp., Aspergillus sp.

 

 

Dermatomikoze

• Dermatofiti-nitasti paraziti na koži (v roževinasti plasti, v kožnih tvorbah dlake, lasje, nohti)
• Prenos: z direktnim stikom z okuženim človekom ali živaljo, s sporami iz okolja ali površin (javna kopališča)

 

 

Dermatofiti

• Microsporium: mikrosporija, epidemije, okužene mačke; odpadanje las in dlak, nastanejo plaki
• Trychophyton: trihofitija, gliva okuži kožo, nohte, lase, hife v obliki jelenovega rogovja
• Epidermophyton: E. floccosum; epidermofitija, na neobraščenih delih kože in nohtih.

 

Sistemske mikoze

• Sistemske mikoze: v notranjih organih (pljuča, jetra, trebušna slinavka, možgani, ledvice, limfnih žlezah).
• Vstop v telo preko ran na koži ali sluznici (dihala, spolovila, sečila), z zrakom.
• Glivične okužbe zdravimo z antimikotiki

 

• Odvzem kužnine: sputum, gnoj, razmaz krvi, biopsijski vzorec iz jeter ali pljuč.

Predstavniki:

• Candida albicans del tel. mikroflore, imunski sistem oslabljen povzroča okužbe. Na KA kvasovka, na koruznem agarju micelij
• Aspergillus niger (črn), fumigatus (zeleno sive)
• Cryptococcus neoformans: osrednje živčevje, pljučnica; likvor, bolniki z AIDS

 

Preiskava

1. Osnovna mikroskopija – screening test
2. Bakteriološko gojišče – priprava mešane kulture (virusi ne zrastejo)
3. Priprava čiste kulture
4. Diferencialna mikroskopija (ločevanje)
5. Identifikacija
6. Antibiogram ali antimikogram

 

Identifikacija

• Uvrstimo bakterijo v sistem (določimo rod in vrsto)
• Včasih moramo določiti tudi tip, sev ali serotip baketrije
• Metode:
• biokemijske preiskave
• ugotavljanje antigenske zgradbe mikroorganizma
• fagotipitzacije
• molekularno-genetske metode
• ugotavljanje specifičnih toksinov

 

Biokemijske metode

• Ugotavljamo razgradnjo substrata ali tvorbo metabolita
• Biokatalizatorji – encimi
• Biokemijska gojišča v katerih testne snovi

 

 

 

Test 1: Poskus na razgradnju glukoze/laktoze, tvorbo plina in H2S

• Gojišče: glukoza in laktoza z dodatkom železovih ionov in natrijevega tiosulfata
• Anaerobna razgradnja glukoze – kisline – dno epruvete se obarva rumeno
• Aerobna razgradnja laktoze – kisline – poševna ploskev gojišča obarvana rumeno
• Tvorba H2S – gojišče se obarva skoraj črno
• Tvorba plina – dvignjeno dno gojišča

 

Test 2: poskus na ureazo

• Gojišče s sečnino in barvilom fenol rdečim
• Ureaza – razgradnja sečnine – sprememba barve v rožnato do vijolično
• Ni ureaze – ni razgradnje sečnine – barva se ne spremeni

 

Test 3: Razgradnja triptofana do indola

• Peptonska voda z aminokosino triptofan
• Dokazujemo indol
• 4-5 kapljic Kovacsevega reagenta – ne mešaj
• Indol + : rdeč obroč na vrhu gojišča
• Indol – : rumen obroč – barva se ne spremeni

 

Test 4: poskus z metilenskim rdečim

• Gojišče: peptonsko gojišče z glukozo in fosfati
• Fermentacija glukoze do kislin
• 5-6 kapljic metilensko rdeče- premešaj
• Navzočnost kislin – gojišče rdeče
• Ni kislin – neobarvano gojišče

 

Test 5: preskus Voges-Proskauer

• Gojišče: tekoče peptonsko gojišče z glukozo in fosfati
• Fermentacija glukoze do acetoin-a
• 10 kapljic α-naftola, 4 kapljice 40 % KOH
• Pretresemo in inkubiramo 5 – 10 min (ne tresemo več)
• Acetoin – rdeč obroč na vrhu gojišča
• Ni acetoina – ni obarvanega obroča

 

 

Test 6: test na citrat

• Gojišče: poševno gojišče s citratom po Simmonsu
• Citrat edini vir ogljika
• Modro gojišče – bakterija lahko uporabi citrat
• Zeleno gojišče – bakterija ne raste

– Testi 4, 5in 6 so sestavni del testa IMViC, za identifikacijo enterobakterij.

 

 

 

 

Test 7: dokaz gibljivosti bakterij

• Gojišče: globoko poltrdo gojišče po Winkleju
• Bakterija je negibljiva- rast le ob vbodni črti
• Bakterija je gibljiva- rast po vsem gojišču (motno gojišče)

 

Test na katalazo

• Katalaza razgradi H₂O₂ do H₂O in O₂
• Ugotavljamo prisotnost kisika
• Rezultat: pojavi se penjenje – katalaza +

 

Test na oksidazo

• Navzočnost citokroma c oz. encima citokrom oksidaze
• Pri dihanju se vodikovi elektroni (H⁺) prenašajo preko citokromov do O₂ in nastane H₂O
• Rezultat: temno škrlatna barva: oksidaza +

ni obarvanosti: oksidaza –

[wp_ad_camp_1]

Sistem API za identifikacijo mikroorganizmov

• Hitri test za identifikacijo bakterij
• Utori s substrati
• Reakcija med bakterijskimi encimi in substrati
• Obdelava z računalniškimi programi

 

Določanje serotipov pri bakterijah

• Včasih biokemijski testi niso dovolj za identifikacijo
• Znotraj vrste različni serotipi
• Bakterija – skupek antigenov – antigenske determinante

 

Antigen

• Molekula, ki ob vstopu v organizem sproži aktivacijo limfocitov in nastanek specifičnih protiteles
• Na bakteriji je lahko več različnih antigenov

 

Escherichia coli O157H7

• Serotip O157H7
• O157 – antigen na celični steni – O antigenska determinanta
• H7 – antigen na bičku – H antigenska determinanta
• Nekatere črevesne bakterije še imajo K antigensko determinano – antigen na kapsuli

 

Določanje serotipov pri bakterijah

• Ugotavljanje antigenske zgradbe bakterij s specifičnimi protitelesi
• Metode:
• aglutinacija
• precipitacija
• imunodifuzija
• imunoflourescenca itn.

 

Antibiogram

• Ugotavljanje občutljivosti oz. odpornosti bakterije za antibiotike
• Metode:
• difuzijska
• dilucijska ali redčitvena
• inkorporacijska
• difuzijska z gradientom (E-test)

 

Difuzijska metoda

• Kvalitativna – določi le ali je bakterija občutljiva ali odporna za antibiotik
• Lahko preverimo občutljivost za več različnih antibiotikov

 

Dilucijska ali redčitvena metoda

• Serija redčitev antibiotika v gojišča z bakterijo
• Kvantitativna metoda
• Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) – antibiotik zavre razmnoževanje bakterijske kulture
• Minimalna baktericidna koncentracija (MBK) – antibiotik ubije bakterije v kulturi

 

Inkorporacijska metoda

• Kvalitativna ali kvantitativna
• Antibiotik vmešamo v gojišče – nato nacepimo bakterijo
• Redčitev antibiotika
• Lahko testiramo različne antibiotike

 

 

 

Difuzijska metoda z gradientom  (E-test)

• Lističi z gradientom antibiotika
• Poskus na trdnem gojišču s testno bakterijo
• Difuzijski prenos antibiotika na v gojišče

 

VIRUSI

• Ali so živi?
• Se razmnožujejo
• Se ne prehranjujejo in ne rastejo
• Imajo le osnoven genetski zapis
• Najdemo jih: pri človeku, živalih, rastlinah in bakterijah
• So najmanjši mikroorganizmi, ki vsebujejo DNK ali RNK, zaščiteno z beljakovinsko ovojnico (kapsido)
• Genom + kapsida = nukleokapsida
• Nekateri virusi imajo še lipidno ovojnico
• Oblika: paličasti, poliedri (ikozaedri), spiralno zaviti in kompleksno zgrajeni
• Opazujemo z elektronskim mikroskopom (400 000x)
• So znotrajcelični zajedalci (gojimo v živi celici)

 

Razmnoževanje virusa

• Gostitelj
• Pri sobni T obstojni le nekaj ur, največ nekaj dni (neaktivni viroidi)
• Lizogeni cikel – virusni DNK se vključi v DNK gostitelja – se podvaja
• Litični cikel – v gostiteljski celici nastanejo novi virusi – sprostijo se z lizo celic

 

Preiskave virusov

• Neposredne:

– Osamitev virusa iz bolnikove kužnine: vbrizgamo jo v  *  celično kulturo, *oplojena kokošja jajca, *poskusno žival.

– Neposredno dokazovanje virusnega antigena Posredne:

z ugotavljanjem specifičnih protiteles v serumu bolnika – serološke metode

 

Gojitev virusov v celičnih kulturah

• Danes največ uporablja
• Celice se množijo v hranljivih gojiščih
• Celice iz humanih ali živalskih tkiv (fibroblastne-vezivne ali epitelijske celice)
• Ločimo primarne in trajne celične seve
• Celični kulturi dodamo virusno suspenzijo (kužnino)
• Kužnino inkubiramo (37 °C, 5 % CO₂)
• Mikroskopsko opazovanje poškodbe celic (citopatski učinek ali CPE, plaki)
• Imunološki testi

 

 

 

Diagnostika virusov:

• Elektronska mikroskopija: če iščemo viruse v kužninah, kjer je veliko virusnih delcev (urin, vsebina mehurčkov)
• Dokazovanje virusnih antigenov:
• Z monoklonskimi specifičnimi protitelesi
• Priprava citološkega preparata iz okuženih celic v kužnini, fiksiranje, dodatek označenih protiteles, mikroskopski pregled vezave protiteles na viruse.

 

• Dokazovanje virusnih nukleinskih kislin:
• S hibridizacijo (lovke)
• S PCR
• Dokazovanje specifičnih protiteles:
• V serumu bolnika
• Kvantitativna metoda (določimo titer protiteles)
• Encimsko imunološki test ELISA (ugotavljamo specifična IgM -sveža okužba, ali IgG- okužba v preteklosti

 

Neposredno dokazovanje mikroorganizmov

• Z izolacijo mikroorganizma (bakterije, glive , redkeje viruse in parazite)
• Z dokazovanjem antigenov mikroorganizmov
• Z dokazovanjem nukleinskih kislin mikroorganizmov
• Z mikroskopiranjem
• S histološkim pregledom vzorcev tkiv in celic (pri virusih)

 

Imunološke metode

• Reakcija med antigenom in protitelesom
• Protitelesa (imunoglobulini) nastanejo kot odziv limfocitov B na spodbudo antigenov, ki so vstopili v organizem
• Antigeni: cele bakterije, deli cel. stene, kapsul, bički, beljakovine bakterij ali virusov, celice gliv, toksini, parazitske živali, njihove sestavine ali presnovki.
• Reakcija med antigenom in protitelesom je:
• strogo specifična
• med vezavo se antigen in protitelo kemijsko ne spremenita
• vezi med antigenom in protitelesom so trdne
• antigeni in protitelesa se vežejo v različnih razmerjih
• Direktne ali neposredne – titer antigenov
• Indirektne ali posredne – titer protiteles

 

Serologija

• Serologija je veda, ki preučuje serumske sestavine ter reakcije med antigeni in protitelesi in vitro.
• Imunološki poskus (antigen – protitelo), ki ga izvajamo v krvnem serumu ali likvorju in vitro, se imenuje serološki poskus.

 

 

 

Serološke reakcije

• Kvantitativna – titer protiteles
• Kvalitativna – navzočnost protiteles različnih razredov (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD), lahko tudi, ali gre za nedavno ali akutno okužbo

Titer je največja razredčitev vzorca, ki še da pozitivno reakcijo.

1. Nevtralizacija toksina z antitoksinom
2. Aglutinacija
3. Precipitacija
4. Reakcija lize
5. Reakcija vezanja komplementa
6. Virusna hemaglutinacija (HA) in inhibicija hemaglutinacije (IHA)
7. Testi nevtralizacije virusov (NT)
8. Testi imunofluorescence (IF)
9. Radioimunske metode (RIA)
10. Encimsko imunološke metode (EIA, ELISA)

 

Serološke reakcije
Aglutinacija

• Reakcija zlepljanja antigena v navzočnosti protiteles.
• Antigen (suspenzija bakterij, eritrocitov ali antigenske molekule vezane na inertne-lateksne delce).
• nastanek večjih aglutinatov

 

Serološke reakcije
Precipitacija

• Ag: precipitinogen, Ab: precipitin,

produkt: precipitat

• Antigen je topna molekula, ekstrahiran iz mikroorganizma
• Ista protitelesa pri precipitaciji kot pri aglutinaciji, le da pri aglutinaciji zaznamo celo bakterijo, katere del je tudi ta topna molekula, ki jo zaznamo pri precipitaciji
• Vidna usedlina

 

Serološke reakcije
Testi imunofluorescence (IF)

• Reagente v seroloških reakcijah lahko označimo s fluorosceini (svetijo v določeni valovni dolžini).
• S fluorosceini označimo protitelesa
• Antigen je vezan na nosilcu
• Direktna in indirektna izvedba
• Vezava označenih Ig na antigen oz. kompleks antigen-protitelo, pod UV sveti rdeče ali zeleno.
• Direktna izvedba:
• fiksirana kužnina z antigenom
• dokazujemo z označenim protitelesom
• Indirektna metoda:
• – antigen na nosilcu + protitelo v serumu + označeni IgG ali IgM (sekundarni protitelesi

 

Serološke metode
Radioimunske metode (RIA)

• Reagent se označi z radioaktivnim izotopom jod (¹²⁵J),
• Po vezavi na kompleks antigen-protitelo, oddaja gama žarke.

 

 

Serološke tehnike
Encimsko imunske metode (EIA, ELISA)

• Antigen ali protitelo označena z encimom.
• Encimi: alkalna fosfataza, hrenova peroksidaza.
• Direktna in indirektna metoda
• Rezultat je sprememba barve

 

ELISA

• Neposredna metoda:
• znano protitelo vežemo na netopen nosilec, dodamo neznano komponento
• dodamo sekundarna specifična protitelesa označena z encimom
• dodamo substrat

 

Posredna ELISA

• Posredna metoda:
• znan antigen vežemo na netopen nosilec, dodamo neznano komponento
• dodamo sekundarna specifična protitelesa označena z encimom
• dodamo substrat

 

Molekularno-biološke diagnostične metode

• Test hibridizacije nukleinskih kislin
• Pomnoževanje nukleinskih kislin PCR
• Uporaba:

– če je v kužnini zelo malo patogenih mikroorganizmov, ki jih moramo dokazati

– identifikacija  določenega mikroorganizma

• Izolacija DNK iz različnih kužnin: krvi, seča, blata, likvorja, tkivnih rezin, celičnih razmazov (tudi zamrznjenih in arhivskih-do 10 let)
• Razbitje celice (encimi, detergenti ,segrevanje)
• Oboritev beljakovin (organska topila in izločitev DNK s precipitacijo z amonijevim acetatom in ledenim etanolom.
• DNK raztopimo v pufru.
• Izolacija RNK zahtevnejša (RNK občutljivejša)

 

 

Verižna reakcija s polimerazo (PCR)

• Zelo občutljiva metoda
• Zelo majhen vzorec – teoretično dovolj že 1 evkariontska celica
• Temelji na pomnoževanju za določen organizem značilnega majhnega dela njegove dedne zasnove (DNK ali RNK)

 

Ločevanje produkta PCR

• Horizontalna elektroforeza v električnem polju:
• od negativnega proti pozitivnemu polu
• manjši delci potujejo hitreje
• uporaba standardov za določitev velikosti produkta

Parazitologija

 

• Parazitologija je veda, ki preučuje odnose med zajedalci in njihovimi gostitelji.
• Je oblika simbioze, pri kateri je gostitelj na račun zajedalca oškodovan.

 

Odnosi med zajedalci in gostitelji:

• Preživetje zajedalca:
• obligatni – ne preživijo brez gostitelja
• fakultativni – preživijo brez gostitelja
• Časovna vezanost zajedalca na gostitelja:
• trajni
• začasni
• Mesto zajedanja:
• ektoparaziti
• endoparaziti
• Specifičnost glede na vrsto:
• Specifični (ena vrsta)
• Nespecifični ( lahko več vrst –klop)
• Število vmesnih gostiteljev (razvojni krog):
• monokseni (ni vmesnega gostitelja)
• heterokseni (eden ali več vmesnih gostiteljev)

 

Vrste medicinsko pomembnih parazitov

• Praživali (Protozoa)
• Črvi (Helminthes)
• Členonožci (Arthropoda)

 

Laboratorijsko spoznavanje praživali:

• Kužnino (iztrebki, kri, sluz, itd.) neposredno opazujemo pod mikroskopom:

Priprava mikroskopskega preparata:

• nativni preparat v fiziološki raztopini, dodatek lugola (ciste-lomni količnik),
• barvanje z eozinom, toluidin modrim, krezil vijoličnim,
• barvanje po Giemsi (azure-eozin-metilensko modrilo),
• Ziehl-Neelsenova metoda (karbol-fuksin),
• Heidenheinova metoda (hematoksilin)
• opazujemo pod manjšo povečavo.
• Krvne in tkivne praživali včasih prepoznamo tudi serološko (ELISA) in molekularno – genetskimi metodami (PCR)

 

Praživali (Protozoa)

• Migetalkarji ali Ciliophora
• Sarcomastigophora:

– amebe ali Sarcodina

– bičkarji ali Mastigophora

• Trosovci ali Apicompleksa
• Microspora
• Črevesni paraziti
• Krvni paraziti
• Tkivni paraziti

Pojavna oblika:

• Trofozoiti (aktivne, parazitske oblike)

Ciste (neaktivne oblike, tudi v okolju

 

Črvi (Helminthes)

• Makroskopski, večcelični, evkarionti
• Trije razredi:
• trakulje (Cestoda)
• metljaji (Trematoda)
• valjasti črvi (Nematodes)

 

Arthropoda (členonožci)

• Paraziti pri človeku:
• Arachnida (pajkovci)
• Insecta (žuželke)
• Značilnosti:
• segmentirano telo
• prenašalci med rezervoarjem in gostiteljem